TNF-α通过激活PI3K/AKT通路促进SW620^Lgr5+结肠癌干细胞增殖

更新时间:2023-05-28

【摘要】目的探讨炎症环境下磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B （PI3K/AKT）通路对SW620Lgr5+结肠癌干细胞（CSC）增殖的影响。方法以人结肠癌SW620、 SW480、 HT29、 HCT116细胞为材料, Western blot法检测四株细胞中干细胞标志物富含亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体5（Lgr5）的表达水平;选用Lgr5表达量最高的SW620细胞,采用荧光激活细胞分选技术（FACS）分析Lgr5+细胞的比例;无血清悬浮培养得到结肠癌球细胞, FACS分选获得结肠癌Lgr5+ CSC,集落形成实验、 5-氟尿嘧啶（5-FU）耐药实验鉴定分选得到的结肠癌Lgr5+CSC生物学特征的变化;肿瘤坏死因子α（TNF-α）处理Lgr5+ CSC建立炎症模型, CCK-8法筛选TNF-α的最适作用浓度及最佳作用时间;采用PI3K/AKT通路抑制剂MK2206处理Lgr5+ CSC,分为空白对照组、 MK2206组、 TNF-α组、 MK2206联合TNF-α组;集落形成实验检测细胞增殖情况,异硫氰酸荧光素标记的膜联素Ⅴ/碘化丙啶（AnnexinⅤ-FITC/PI）双标记结合流式细胞术检测细胞凋亡情况;Western blot法检测AKT、磷酸化的AKT（p-AKT）、糖原合酶激酶3β（GSK-3β）、磷酸化的GSK-3β（p-GSK-3β）蛋白水平。结果 SW620细胞中Lgr5的蛋白表达量显著高于其他细胞系;FACS分析得到SW620细胞中Lgr5+细胞比例为6.9%,无血清培养基悬浮培养后,分选得到SW620Lgr5+ CSC的比例为34.5%;与SW620细胞相比, SW620Lgr5+ CSC的增殖能力与耐药性显著提高;1 ng/mL TNF-α作用24 h时,SW620Lgr5+ CSC具有最高的细胞活力;与对照组相比, TNF-α显著增加SW620Lgr5+ CSC的集落形成能力,但MK2206显著性降低SW620Lgr5+ CSC的集落形成能力,增加SW620Lgr5+ CSC的凋亡率;同时MK2206显著降低TNF-α诱导的SW620Lgr5+ CSC的集落形成能力,增加其凋亡比例。TNF-α处理增加SW620Lgr5+ CSC中AKT和GSK-3β的磷酸化水平,但MK2206可抑制TNF-α诱导的AKT和GSK-3β的磷酸化水平。结论 TNF-α通过激活PI3K/AKT信号通路促进SW620Lgr5+ CSC增殖。

【关键词】 结直肠癌(CRC) 癌症干细胞(CSC) TNF-α PI3K/AKT信号通路 细胞增殖

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